当前位置: 首页 >> 科研服务 >> 正文

细胞组科研服务项目

2016年12月21日 16:06  

一、单克隆抗体制备量化办法

项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

1

小鼠免疫

①首次免疫:等体积抗原与弗氏完全佐剂乳化,皮下多点免疫小鼠;

②二次加强免疫:等体积抗原与弗氏不完全佐剂乳化,皮下多点免疫小鼠;

③第三次免疫:用NS稀释Ag,腹腔免疫小鼠;

④第四次免疫:融合前三天,用NS稀释Ag,腹腔免疫小鼠;

⑤免疫效价检测:小鼠尾静脉采血,分离血清;包被抗原进行免疫效价检测。

2

细胞融合

①细胞准备:复苏SP2/0并扩大培养;

②制备饲养细胞层:无菌取正常balb/c小鼠脾脏并制成单个脾细胞悬液,铺96孔细胞培养板;

③融合:无菌取免疫小鼠脾脏并制成单个脾细胞悬液,与SP2/0融合并把融合细胞转入HAT培养基,并滴入已有饲养细胞的培养板150ul/孔;

④首次换液:融合后4天换成半量HAT培养基200ul/孔;

⑤第二次换液:融合后7天左右(即未融合的SP2/0和脾细胞死后)换成HT培养基,200ul/孔。

3

细胞建株

①融合板检测:待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上,用ELISA间接法检测,在ELISA质控合格后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作首次克隆化;

②首次克隆化及检测:挑出融合板阳性孔计数取50个细胞混均铺96孔细胞培养板6纵列;待亚克隆生长7-10天,克隆长大即可用ELISA方法检测;

③第二次克隆化及检测:挑选首次克隆化板子中的单克隆孔,其中单克隆细胞≥8个/株,进行ELISA检测,挑取亚克隆检测阳性值高的孔计数取50个细胞铺96孔细胞培养板6纵列,待单克隆生长7-10天进行检测;

④细胞株确立:待2-3次单克隆检测全阳后挑出一孔/株,作扩大培养于24孔板,24孔板细胞长满后作交叉Ag鉴定和稳定性鉴定,鉴定合格后扩大培养于细胞瓶,并进行冻存。

4

腹水制备

①小鼠准备:在打腹水前,7—30天内致敏小鼠选石蜡油0.5ml/只腹腔注射;

②打腹水:收集合格杂交瘤细胞加于PBS(PH值7.4)或生理盐水中,200万-500万/只鼠,腹腔注射;

③腹水收集:杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后7-10天即可腹水收集;

④腹水保存:抽取腹水后置4℃过夜。离心3000rpm×10min.取上清分装置于-20℃。

二、多克隆抗体制备量化办法

项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

1

兔子免疫

①首次免疫:等体积抗原与弗氏完全佐剂乳化,腹股沟皮下多点免疫兔子;

②二次加强免疫:等体积抗原与弗氏不完全佐剂乳化,腹股沟皮下多点免疫兔子;

③第三次免疫:用NS稀释Ag,耳缘静脉加强免疫;

④免疫效价检测:耳缘静脉采血,分离血清;包被抗原进行免疫效价检测。

2

多抗收集

① 准备器械,并进行高压灭菌;

② 兔子准备,暴露颈总动脉并取血;

③ 分离血清,分装冷冻保存

三、其他服务项目

项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

主要用途及说明

1

新玻璃器皿的洗消

①自来水刷洗,除去灰尘;②烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时;③再刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干;④泡酸、清洗:用清洁液浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次, 后蒸馏水冲洗3-5次。先烘干,然后用牛皮纸包装;⑤高压消毒:包装好的器皿装入高压锅进行高压灭菌。

去除灰尘,保证无菌

2

旧玻璃器皿的洗消

①刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入洗涤剂溶液中,再用清水刷洗干净,然后烘干;②泡酸、清洗:烘干后泡酸液12小时后用自来水冲洗,再用蒸馏水冲洗3次;③烘干、包装:洗干净的器皿烘干用牛皮纸包装;④高压消毒:包装好的器皿装入高压锅进行高压灭菌

去除灰尘,保证无菌

3

金属器械洗消

①金属器皿先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净;②用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干;③放入铝制盒内包装好在高压锅高压灭菌,烘干备用

去除灰尘,保证无菌

4

复苏细胞

①打开恒温水浴锅,将温度调至37℃;②把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中;③待融化后1000转离心5分钟;④倒掉上清,把细胞悬浮起来,吸到装有培养基的培养瓶中置于37℃,5%CO2培养箱培养,适时更换培养基。

5

细胞传代

培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时,根据细胞种类把细胞传到几个培养瓶中;继续培养

扩增培养细胞

6

冻存细胞

收集对数生长期的细胞,用配好的冻存液把细胞悬浮起来,分装到灭菌的冻存管中,写明细胞种类,冻存日期。4℃30min,-20℃30min,-80℃过夜,然后放到液氮灌中保存。

保存细胞

7

原代细胞培养

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器皿中,将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中培养。

8

细胞凋亡

准备细胞铺板(根据实验方法不同,选择不同规格细胞培养板),

收集细胞,检测

9

细胞活力

准备细胞铺96孔板,弃上清,分别加等量培养液及WST,置于酶标仪进行检测

10

细胞刺激

准备细胞计数铺板(根据实验方案不同,选择不同规格细胞培养板),根据实验设计引入不同刺激因子或诱导因子,进行后续实验。

上一条:免疫试验组科研服务项目

关闭

医院主站设为首页加为收藏
陕西省人民医院版权所有
电 话:029-85251331传 真: 029-85236987 E-Mail:spphyzxx@163.com
地 址:西安市友谊西路256号 | 邮 编:710068