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如何更好的培养细胞?

2016年12月28日 09:19  点击:[]

有经验和刚刚从事细胞培养工作的人员都应该认真仔细地询问下细胞提供方提供的建议,提前了解所要培养细胞的详细资料,准备好细胞所要用到的培养基和相关试剂,虽然所有的贴壁,半贴壁或者悬浮细胞处理方式差不多,但是不同的实验室培养条件和处理力度还有试剂的批间差这些问题存在,也会导致对细胞处理不当,或者环境的不适应而造成细胞的死亡。

1.收到细胞,第一时间要镜检:观察细胞形态是否正常,对于贴壁细胞则要注意看贴壁情况是否很好,观察细胞密度,有疑议及时咨提供细胞的技术人员。由于运输的时间或者温度的变化,很多贴壁细胞在盛满培养基的瓶子里生长的状态和平时会有点不一样,主要是贴壁牢固问题。比如293T,平时贴壁就不是很牢,在装满的培养基瓶子里面,会发生大片的脱落,细胞聚集在一起,但是细胞生长还是正常的,通过离心收集,加以胰酶的消化,重新打散,又可以正常的贴壁生长。

2.当通过上一步的观察,细胞初步没有任何问题时,进行下一步操作。当收到的细胞密达到80%左右时,则处理如下:弃除瓶中大部分培养基,仅保留5到10mL培养所需的常规培养基;或更换新鲜的培养基,置于培养箱中,随后每天观察。细胞在低于正常生长温度情况下,会调整为静止期,或者慢速生长期,必须恢复37度的环境至少3个小时左右,才能重新调整到接近对数生长期的状态,在对数生长期进行细胞的传代会大大增加传代的成功率,和细胞的存活率。

3.如果经第一步观察发现细胞密度超过90%,并且细胞状态很好时,则复温后2个小时需要立即传代。传代的比例应依据不同的细胞而定。对于生长比较快,状态稳定,不易受外界影响的细胞可以一次多传几瓶;对于生长较慢,细胞比较薄,状态容易波动的细胞类型,一次少传些,保证每瓶细胞密度大些,便于稳定生长。至于一些比较陌生的细胞,第一次处理也可以依照第二种情况。

传代操作:

1.吸除培养瓶内旧培养液。

2.加入无菌pbs洗液(5-8mL)轻轻润湿细胞,稀释多余的培养基,之后吸走洗液,动作要轻,不可吹打到细胞。

3.向瓶内加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少许,以能覆满瓶底为限。

4.置温箱中2-5分钟,一旦镜检发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,细胞变圆,比较松动后,立即终止消化。

5.加入该细胞对应的培养基6mL(T25培养瓶)或12mL(T75培养瓶)终止消化。

6.用吸管通过吸取的培养基轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时应尽量以 少的次数将细胞从壁上吹下,不仅要控制吹打的力度、次数,还要注意要将细胞尽可能吹成单个。这样既能减少死细胞,又能便于细胞再次均匀贴壁生长。

7.依据传代比例,将细胞悬液分瓶,再补充培养基后,静置于温箱培养,直止贴壁。

贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后,继续生长的空间不足,培养基中的营养成份也消耗较多,同时代谢废物也有较多堆积,需要分瓶培养,对细胞进行传代扩增。对于贴壁不太紧的细胞如293,可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO,则需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以笔者的经验,以轻吹或加培养液后轻摇可下较好,但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。

胰酶消化的程度是一个关键:消化过度则对细胞的活性影响较大,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、解冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶会比不含的消化能力强很多,不同细胞对消化液的敏感性也不同,比如HEP-G2人肝癌细胞,该细胞消化时间可长达10分钟左右。 消化时间仔细去摸索一下,每过2分钟镜下观察细胞是否变圆,记录消化时间,下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

对于悬浮细胞换液时只需要补液就行。

悬浮细胞的传代则不需要用胰酶消化,直接通过计数算好传代的比例,直接分瓶,补液。有些悬浮细胞趋于成团生长,此时细胞生长状态良好,当补液时,避免吹打。典型实例:jurkat就是成团生长。当jurkat细胞密度比较大时,可将培养瓶竖直放置2分钟左右,待大部分细胞沉下,吸走上层清液,补充等量的新鲜培养基。

上一条:细胞冻存、解冻方法与细胞计数

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