项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

1

小鼠免疫

①首次免疫：等体积抗原与弗氏完全佐剂乳化，皮下多点免疫小鼠；

②二次加强免疫：等体积抗原与弗氏不完全佐剂乳化，皮下多点免疫小鼠；

③第三次免疫：用NS稀释Ag，腹腔免疫小鼠；

④第四次免疫：融合前三天，用NS稀释Ag，腹腔免疫小鼠；

⑤免疫效价检测：小鼠尾静脉采血，分离血清；包被抗原进行免疫效价检测。

2

细胞融合

①细胞准备：复苏SP2/0并扩大培养；

②制备饲养细胞层：无菌取正常balb/c小鼠脾脏并制成单个脾细胞悬液，铺96孔细胞培养板；

③融合：无菌取免疫小鼠脾脏并制成单个脾细胞悬液，与SP2/0融合并把融合细胞转入HAT培养基，并滴入已有饲养细胞的培养板150ul/孔；

④首次换液：融合后4天换成半量HAT培养基200ul/孔；

⑤第二次换液：融合后7天左右（即未融合的SP2/0和脾细胞死后）换成HT培养基，200ul/孔。

3

细胞建株

①融合板检测：待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上，用ELISA间接法检测，在ELISA质控合格后挑选阳性孔（一般OD450≥0.5）作首次克隆化；

②首次克隆化及检测：挑出融合板阳性孔计数取50个细胞混均铺96孔细胞培养板6纵列；待亚克隆生长7-10天，克隆长大即可用ELISA方法检测；

③第二次克隆化及检测：挑选首次克隆化板子中的单克隆孔，其中单克隆细胞≥8个/株，进行ELISA检测，挑取亚克隆检测阳性值高的孔计数取50个细胞铺96孔细胞培养板6纵列，待单克隆生长7-10天进行检测；

④细胞株确立：待2-3次单克隆检测全阳后挑出一孔/株，作扩大培养于24孔板，24孔板细胞长满后作交叉Ag鉴定和稳定性鉴定，鉴定合格后扩大培养于细胞瓶，并进行冻存。

4

腹水制备

①小鼠准备：在打腹水前，7—30天内致敏小鼠选石蜡油0.5ml/只腹腔注射；

②打腹水：收集合格杂交瘤细胞加于PBS（PH值7.4）或生理盐水中，200万-500万/只鼠，腹腔注射；

③腹水收集：杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后7-10天即可腹水收集；

④腹水保存：抽取腹水后置4℃过夜。离心3000rpm×10min.取上清分装置于-20℃。

项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

1

兔子免疫

①首次免疫：等体积抗原与弗氏完全佐剂乳化，腹股沟皮下多点免疫兔子；

②二次加强免疫：等体积抗原与弗氏不完全佐剂乳化，腹股沟皮下多点免疫兔子；

③第三次免疫：用NS稀释Ag，耳缘静脉加强免疫；

④免疫效价检测：耳缘静脉采血，分离血清；包被抗原进行免疫效价检测。

2

多抗收集

① 准备器械，并进行高压灭菌；

② 兔子准备，暴露颈总动脉并取血；

③ 分离血清，分装冷冻保存

项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

主要用途及说明

1

新玻璃器皿的洗消

①自来水刷洗，除去灰尘；②烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时；③再刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干；④泡酸、清洗：用清洁液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次， 后蒸馏水冲洗3-5次。先烘干，然后用牛皮纸包装；⑤高压消毒：包装好的器皿装入高压锅进行高压灭菌。

去除灰尘，保证无菌

2

旧玻璃器皿的洗消

①刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入洗涤剂溶液中，再用清水刷洗干净，然后烘干；②泡酸、清洗：烘干后泡酸液12小时后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗3次；③烘干、包装：洗干净的器皿烘干用牛皮纸包装；④高压消毒：包装好的器皿装入高压锅进行高压灭菌

去除灰尘，保证无菌

3

金属器械洗消

①金属器皿先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净；②用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干；③放入铝制盒内包装好在高压锅高压灭菌，烘干备用

去除灰尘，保证无菌

4

复苏细胞

①打开恒温水浴锅，将温度调至37℃；②把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中；③待融化后1000转离心5分钟；④倒掉上清，把细胞悬浮起来，吸到装有培养基的培养瓶中置于37℃，5%CO2培养箱培养，适时更换培养基。

5

细胞传代

培养瓶中的细胞覆盖率达到80%-90%时，根据细胞种类把细胞传到几个培养瓶中；继续培养

扩增培养细胞

6

冻存细胞

收集对数生长期的细胞，用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

保存细胞

7

原代细胞培养

在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定)，经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器皿中，将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中培养。

8

细胞凋亡

准备细胞铺板（根据实验方法不同，选择不同规格细胞培养板），

收集细胞，检测

9

细胞活力

准备细胞铺96孔板，弃上清，分别加等量培养液及WST，置于酶标仪进行检测

10

细胞刺激

准备细胞计数铺板（根据实验方案不同，选择不同规格细胞培养板），根据实验设计引入不同刺激因子或诱导因子，进行后续实验。