项目编号

实验项目名称

主要实验步骤

主要用途及说明

1

DNA提取（细胞、血液）

破膜裂解细胞；核酸分离，纯化；乙醇沉淀；洗脱；测定其浓度

从细胞、全血或组织中提取基因组DNA，提取的DNA适用于酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等常规实验，同时也满足芯片杂交、高通量测序等高质量DNA的需求

2

DNA提取（组织）

通过机械，物理，化学等方法破碎裂解组织细胞→漂洗→洗脱→测定浓度

3

RNA提取（细胞、血液）

样品前处理→细胞裂解→RNA的纯化→洗脱→测定其浓度

可用于Northern Blot、Dot Blot、PolyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆

4

RNA提取（组织）

液氮中将组织研磨成粉→加Trizol裂解细胞→漂洗RNA→洗脱RNA→测定浓度

5

反转录

将提取的RNA反转录成cDNA

反转录的cDNA用于测序或PCR

6

设计合成引物

查找序列→序列比对→设计引物加酶切位点→软件验证

用于普通PCR或荧光PCR

7

设计合成探针

查找序列→序列比对→设计探针→软件验证

用于普通PCR或荧光PCR

8

普通PCR

变性、退火、延伸三个过程→配制mix并加样

一次不超过30个样本

9

琼脂糖凝胶电泳

配制不同浓度的琼脂糖凝胶→加样→电泳→紫外成像系统进行拍照

一批 多34个样本

10

DNA纯化回收

紫外灯照射下切下目的条带→称重→溶解→过柱→漂洗→洗脱→测定浓度

纯化回收的DNA适用于酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化等实验

11

目的基因调取，连接T载体（<1kb）

模板获取 （基因组DNA提取或总RNA的提取及反转录）→从模板中PCR目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳，有阳性条带割胶回收→将目的基因连入T载体，16℃连接→转化，将连接产物转入感受态细胞中，蓝白斑筛选→挑取白色挑克隆摇菌→PCR鉴定菌液，若有阳性则提取质粒并送测序公司测序

用T载体作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去，利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制

12

目的基因调取，连接T载体（1kb~2kb）

模板获取 （基因组DNA提取或总RNA的提取及反转录）→从模板中PCR目的基因片段，琼脂糖凝胶电泳，有阳性条带割胶回收→将目的基因连入T载体，16℃连接过夜→转化，将连接产物转入感受态细胞中，蓝白斑筛选→挑取白色挑克隆摇菌→PCR鉴定菌液，若有阳性则提取质粒并送测序公司测序

用T载体作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去，利用他在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制

13

构建表达（原核/真核）载体

PCR(含酶切位点)→酶切，琼脂糖凝胶电泳割胶回收→连接（将酶切好的阳性片段连入表达载体中）→转化入感受态细胞中→挑克隆鉴定（PCR）→提取质粒

用表达载体作为运载工具，实现目的蛋白在真核/原核表达体系中的表达

14

原核表达

活化菌株，提质粒→转化表达菌株→挑克隆摇菌诱导→蛋白鉴定→纯化（3~5天）→复性，浓缩

获得蛋白量1mg左右

15

细胞转染质粒、siRNA

根据实验需要铺细胞→利用转染试剂将需要转染的东西转入细胞中→根据实验时间点收样品（核酸或蛋白）

检测目的蛋白或siRNA的作用

16

质粒小提

收集菌体（1~5ml）→裂解菌液→收集裂解菌体的上清→上清过吸附柱→清洗吸附柱→洗脱液洗脱吸附柱，得到质粒溶液

提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。

17

质粒中提

收集菌体（5~15ml多次离心）→裂解菌液→收集裂解菌体的上清→上清过吸附柱→清洗吸附柱→洗脱液洗脱吸附柱，得到质粒溶液

18

质粒大提

收集菌体（大量培养细菌多次离心）→裂解菌液→收集裂解菌体的上清（特殊手推柱加上多次离心）→上清过吸附柱（大量离心）→清洗吸附柱→洗脱液洗脱吸附柱，得到质粒溶液

19

Real-time PCR检测

根据需要检测的基因配制相应的反应mix，每个样品做3个复孔

检测目的蛋白在mRNA水平的表达量

20

蛋白提取

收集细胞→加入Buffer，并进行破碎→收集样品

获取蛋白样品

21

蛋白定量

收集蛋白样品→蛋白变性→点膜→固定→氨基黑染色→漂洗→脱色→绘制标准曲线及检测样品

确定上样量（一次不超过20个样本）

22

蛋白电泳

电泳（SDS-PAGE凝胶配制、样品处理、上样与电泳）→考马斯亮蓝染色→脱色→观察目的条带

观察蛋白的表达水平

23

Western blotting检测

电泳（SDS-PAGE凝胶配制、样品处理、上样与电泳）→转膜→丽春红染色→一抗孵育→二抗孵育→蛋白检测

检测目的蛋白在蛋白水平的表达量

24

免疫共沉淀

收集细胞及裂解→加入抗体→加入Protein G/A珠→结合目标蛋白

→检测

以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的首选方法。

25

细胞免疫荧光

爬片前准备→固定→通透化→封闭→一抗孵育→二抗孵育→染核→封片→镜检

细胞免疫荧光测定的目的在于利用化学反应所呈现的颜色,在原位上确定组织细胞结构的化学成分和化学性质

26

WST-1细胞增殖、细胞毒性检测

接种细胞，孵育过夜→加入待检样品及WST溶液→37℃孵育→检测及分析

细胞增殖、细胞毒性检测